Mesterséges táptalajokon nőhet

A MIKROORGANIZMUSOK MŰVELÉSÉRE VONATKOZÓ MÓDSZEREK. KULTÚRAI ÉS BIOKÉMIAI TANULMÁNY

TULAJDONSÁGOK

A tenyésztést, vagyis a mikroorganizmusok laboratóriumi tenyésztését használják tulajdonságaik tanulmányozására és biomassza megszerzésére. Táptalajokon baktériumokat, gombákat, aktinomicetákat, spirochetákat és néhány protozoát tenyésztenek. A chlamydia, a rickettsia, a vírusok és egyes protozoonok csak az állat testében vagy élő sejtekben szaporodhatnak.

Az ilyen típusú mikroorganizmusok kulturális tulajdonságai a következők: 1) a szaporodáshoz szükséges feltételek és 2) a táptalajokon történő növekedés jellege. A kulturális tulajdonságok egyike azoknak a jellemzőknek, amelyeket figyelembe vesznek a mikroorganizmusok azonosításakor (típusának meghatározásakor).

Kulturális média

A táptalajoknak meg kell felelniük bizonyos követelményeknek. Tartalmazniuk kell az ilyen típusú mikrobák reprodukciójához szükséges összes tápanyagot. Egyes kórokozó mikroorganizmusok egyszerű táptalajokon nőnek, míg másoknak vérre, vérszérumra és vitaminokra van szükségük a szaporodásukhoz.

A tenyésztőközegben bizonyos körülményeket nátrium -klorid vagy pufferoldatok hozzáadásával kell megteremteni. A legtöbb baktérium számára előnyös a 0,5% nátrium -kloridot tartalmazó tápközeg. A legtöbb patogén baktérium számára kedvező tápközeg reakciója enyhén lúgos, ami a pH = 7,2-7,4 értéknek felel meg. A Vibrio cholerae pH = 7,8-8,5, a gombák-pH = 5-5,5 mellett nő. A táptalajnak nedvesnek kell lennie, vagyis elegendő mennyiségű vizet kell tartalmaznia, a lehető legátlátszóbbnak és sterilnek kell lennie, azaz vetés előtt nem tartalmazhat mikrobákat.

Összetételét és eredetét tekintve a tápközeg természetes, mesterséges és szintetikus. A természetes táptalajok természetes termékek, például burgonya és más zöldségek. A mesterséges táptalajokat egy speciális recept szerint állítják elő termékekből, szerves és szervetlen vegyületek hozzáadásával. A szintetikus közegek bizonyos kémiai vegyületeket tartalmaznak ismert koncentrációban.

Konzisztenciájuk szerint a táptalajok folyékonyak, félig folyékonyak, sűrűek. Tömítőanyagként általában tengeri moszatból izolált agar-agar-poliszacharidot használnak. Az agar-agart a mikroorganizmusok nem használják tápanyagként; vízben gélt képez, amely 100 ° C-on olvad és 45 ° C-on megszilárdul.

A sűrű tápközeg megszerzése érdekében agar-agart adunk hozzá 1,5-2%koncentrációban, félig folyadék esetén-0,5%.

Rendeltetésüknek megfelelően a tenyésztőközegeket szokásos (egyszerű), speciális, választható, differenciáldiagnosztikára lehet osztani.

Hagyományos (egyszerű) táptalajokat használnak a legtöbb mikroorganizmus tenyésztésére, ez a mezopátiám húsleves (MPB), a mezopátmia agar (MPA).

Speciális táptalajokat használnak olyan mikroorganizmusok tenyésztésére, amelyek nem egyszerű táptalajon nőnek. Például vér agar és cukor húsleves streptococcus, szérum agar meningococcus és gonococcus esetén.

Választható táptalajokat használnak egy faj elkülönítésére különböző baktériumok keverékéből. Ez a fajta baktérium gyorsabban és jobban növekszik ezen a környezeten, mint mások, növekedésükben felülmúlva őket; ezen a táptalajon más baktériumok növekedése késik. Például alvadt szérum diftéria bacillus, lúgos pepton víz kolera vibrio, epe húsleves tífusz bacillus, sós közeg staphylococcus ellen.

Differenciáldiagnosztikai táptalajokat használnak bizonyos típusú baktériumok megkülönböztetésére másaktól enzimatikus aktivitásuk alapján (lásd a megfelelő részt).

Az aerob baktériumok tiszta tenyészetének tenyésztése és izolálása

A mikroorganizmusok tenyésztéséhez bizonyos feltételek szükségesek: hőmérséklet, aerob vagy anaerob körülmények.

A hőmérsékletnek optimálisnak kell lennie a faj számára. A legtöbb patogén baktérium 37 ° C -on szaporodik. Egyes fajok esetében azonban az alacsonyabb hőmérséklet az optimális, ami összefüggésben áll ökológiájuk sajátosságaival. Tehát a pestisbacillus esetében, amelynek természetes élőhelye rágcsálók a hibernáció során, az optimális hőmérséklet 28 ° C, valamint a leptospirák esetében a botulizmus bacillus esetében - 28 ° C -35 ° C.

Az optimális hőmérséklet mellett a mikroorganizmusok tenyésztéséhez a fajtól függően aerob vagy anaerob környezetre van szükség.

A mikrobák morfológiájának, kulturális, biokémiai és egyéb tulajdonságainak tanulmányozása érdekében tiszta tenyészetet kell szerezni. Általában a mikrobák tenyészetét nevezik azoknak a táptalajra történő felhalmozódásának zavarosság, aljközeli (fal) növekedés vagy film formájában a folyékony közeg felületén vagy telepeken sűrű táptalajon. Egyetlen telep képződik egy mikrobiális sejtből. A tiszta tenyészet ugyanazon faj mikrobáinak tenyésztése, amely egyetlen kolóniából származik. A laboratóriumokban bizonyos ismert mikrobatörzseket használnak különböző vizsgálatokhoz. A törzs egy specifikus forrásból, meghatározott időben, ismert tulajdonságokkal rendelkező tiszta mikroorganizmus -tenyészet. A mikrobiális törzseket jellemzően meghatározott számmal jelölik. Például a Staphylococcus aureus 209P törzset használják a penicillin aktivitásának meghatározására.

A tiszta aerob tenyészetek izolálása általában három napig tart, és a következő séma szerint történik:

1. nap - a vizsgálati anyagból származó kenet mikroszkópiája, festve (általában Grammal) - a mikroflóra előzetes megismeréséhez, amely hasznos lehet az oltáshoz használt táptalaj kiválasztásában. Ezután az anyagot beoltjuk a fagyasztott tápanyag agar felületére, hogy izolált telepeket kapjunk. A szitálás a Drygalsky módszer szerint elvégezhető három Petri -csészébe tápközeggel. Egy csepp anyagot viszünk fel az első csészére, és spatulával eloszlatjuk az egész csészén. Ezután ugyanazzal a spatulával oszlassa el rajta a fennmaradó tenyészetet a második csészén, és ugyanígy a harmadik csészén. A legtöbb kolónia az első lemezen nő, a legkevesebb a harmadikon. Az egyik lemezen elszigetelt telepek nőnek, attól függően, hogy hány mikrobiális sejt volt a vizsgálati anyagban.

Ugyanezt az eredményt lehet elérni egy csésze szitálásával. Ehhez ossza a csészét négy szektorra. A vizsgált anyagot bakteriológiai hurokkal oltjuk be az első szektoron, majd a kalcinálás és lehűtés után az oltást elosztjuk az első szektorból a másodikba, és ugyanígy szekvenciálisan a harmadik és negyedik szektorba. Az izolált telepeket az egyes mikrobiális sejtekből 24 órás termosztátos inkubálás után alakítják ki.

2. nap - lemezeken termesztett telepek vizsgálata, leírásuk. A telepek átlátszóak, áttetszők vagy átlátszatlanok lehetnek, különböző méretűek, lekerekített szabályos vagy szabálytalan körvonalak, domború vagy lapos alakúak, sima vagy érdes felületűek, sima vagy hullámos, szaggatott élek. Lehet színtelen vagy fehér, arany, piros, sárga. Ezen jellemzők vizsgálata alapján a felnőtt telepeket csoportokra osztják. Ezután egy izolált kolóniát választanak ki a vizsgálati csoportból, kenetet készítenek a mikroszkópos vizsgálathoz annak érdekében, hogy ellenőrizzék a telep mikrobáinak homogenitását. Ugyanezt a kolóniát oltják be egy kémcsőbe ferde tápanyag -agarral.

3. nap - az agaron ferde tenyészet tisztaságának ellenőrzése kenetmikroszkóppal. A vizsgált baktériumok homogenitásával a tiszta tenyészet izolálása teljesnek tekinthető.

Az izolált baktériumok azonosítása érdekében tanulmányozzák a kulturális tulajdonságokat, vagyis a folyékony és szilárd táptalajokon való növekedés jellegét. Például a cukorlevesben lévő streptococcusok alsó és parietális üledéket képeznek, a vér agaron - kicsi, pontos telepeket; a kolera vibrio fóliát képez az alkalikus peptonvíz felszínén, és átlátszó telepeket alkálikus agaron; a pestisbacillus tápláló agaron "csipke zsebkendők" formájában gyarmatokat képez, sűrű központtal és vékony hullámos szélekkel, és folyékony táptalajban - film a felületen, majd szálak, amelyek "stalaktitok" formájában nyúlnak ki ".

Anaerob baktériumok tiszta tenyészetének tenyésztése és izolálása

Az anaerobok tenyésztéséhez csökkenteni kell a közeg oxidációs-redukciós potenciálját, anaerobiosist kell létrehozni az oxigén fizikai, kémiai vagy biológiai módszerekkel történő eltávolításával.

A fizikai módszerek a következők:

1) a levegő mechanikus eltávolítása szivattyú segítségével az anae-rostatból, amelybe oltott edényeket helyeznek. Ugyanakkor a levegőt közömbös gázzal helyettesítheti: nitrogén, hidrogén, szén -dioxid.

2) redukáló anyagokat tartalmazó tápközegben való termesztés. A Kitta-Tarozzi szerda cukorleves máj- vagy húsdarabokkal. A glükóz és a szervdarabok redukáló képességgel rendelkeznek. A közeget ráöntjük egy réteg vazelinolajjal, hogy megakadályozzuk a levegő oxigénjének hozzáférését.

3) A legegyszerűbb, de kevésbé megbízható módszer az, ha mélyen nő egy magas cukor agar oszlopban.

A kémiai módszerek abból a tényből állnak, hogy az anaerob növényeket tartalmazó edényeket hermetikusan lezárt exszikkátorba helyezik, ahol vegyszereket helyeznek el, például pirogallolt és lúgot, amelyek között a reakció oxigén felszívódásával folytatódik.

A biológiai módszer alapja az anaerobok és aerobok egyidejű tenyésztése szilárd táptalajokon Petri -csészékben, hermetikusan lezárva az oltás után. Először az oxigént szívják fel a növekvő aerobok, majd megkezdődik az anaerobok növekedése.

A tiszta anaerob tenyészet izolálása az anaerob baktériumok felhalmozódásával kezdődik Kitta-Tarozzi táptalajra történő beoltással. A jövőben az izolált telepeket kétféleképpen lehet megszerezni:

1) az anyagot oltott meleg cukor agarral üvegcsövekben összekeverve oltjuk be. Az agar megszilárdulása után elszigetelt telepek nőnek a mélyén, amelyeket a cső átvágásával távolítanak el, és Kitt-Tarozzi táptalajon tenyésztenek (Weinberg módszer);

2) az anyag beoltását tápközeggel ellátott lemezekre végezzük, és anaerosztátban inkubáljuk. A tányéron tenyésztett izolált telepeket Kitt-Tarozzi táptalajon (Zeissler módszer) szubkultúrázzuk.

Más mikroorganizmusok tenyésztése

A mikoplazmák tenyésztése

A mikoplazmákat szérummal és szénhidrátokkal kiegészített táptalajokon tenyésztik. Mivel a mikoplazmáknak nincs sejtfaluk, csak izotóniás vagy hipertóniás környezetben nőnek. Szilárd táptalajokon több napon keresztül nagyon kis telepek képződnek, amelyek hasonlítanak a sült tojásokhoz - domború központtal és lapos áttetsző perifériával. A mikoplazmákat csirkeembrióban vagy sejtkultúrában is lehet termeszteni.

A rickettsia és a chlamydia termesztése

A rickettsiae és a chlamydiae kötelező intracelluláris paraziták. Termesztésükhöz sejttenyészeteket, csirkeembriókat és állati fertőzést használnak.

Gomba termesztés

A gombatermesztéshez sűrű és folyékony táptalajokat használnak: leggyakrabban a Sabouraud táptalaját, valamint a sörlevet tartalmazó táptalajt. A gombák lassabban nőnek, mint a baktériumok, néhány napon belül látható növekedést képeznek. A tenyésztési hőmérséklet alacsonyabb, mint a baktériumoké - 22-30 ° C.

Spirochetek és protozoonok termesztése

A spirocheták közül a legegyszerűbb a leptospirák termesztése, amelyekhez a nyúl vérszérumával kevert víz tápanyagként szolgálhat.A borreliát és a treponemát anaerob körülmények között tenyésztik bonyolultabb táptalajokon, amelyek szérumot, állati szövetdarabokat tartalmaznak.

A protozoonok közül a dizentériás amőba, a lamblia, a Trichomonas, a leishmania, a trypanosome, a balantidia tenyészthető táptalajokon, a Toxoplasma csirkeembrióban és szövettenyészetben. A malária plazmodia tenyésztési módszerei fejlesztés alatt állnak.

Módszerek az enzimatikus aktivitás vizsgálatára (biokémiai tulajdonságok)

A mikrobiológiai gyakorlatban az enzimatikus aktivitás vizsgálatát használják a mikroorganizmusok azonosítására, mivel minden mikrobiális fajnak van egy bizonyos enzimkészlete.

A proteolitikus aktivitás meghatározásához a mikrobákat injektáljuk egy zselatinoszlopba, és 3-5 napos szobahőmérsékleten történő inkubálás után a zselatin cseppfolyósodásának jellegét figyeljük meg: tölcsér, köröm, harisnya formájában vagy felborult karácsonyfa formájában. A proteolitikus aktivitást meghatározza a fehérje bomlástermékeinek képződése is: indol, hidrogén -szulfid, ammónia. Ezek meghatározásához mikroorganizmusokat oltanak be hús-pepton húslevesbe, és indikátorpapírokat helyeznek a kémcső nyaka és egy pamut dugó közé, kizárva a közeggel való érintkezésüket. Indol képződésekor az oxálsav telített oldatával impregnált papír rózsaszínűvé válik; hidrogén -szulfid jelenlétében az ólom -acetáttal impregnált papír feketére színeződik; ammónia képződésekor a piros lakmuszpapír kék színűvé válik.

A mikrobák szacharolitikus tulajdonságainak meghatározásához differenciáldiagnosztikai közegeket használnak, például Giss táptalajt, Olkenitsky táptalajt, Endo táptalajt, Levin táptalajt, Ploskirev táptalajt.

Az Endo, Levin, Ploskirev médiákat a Petri -csészékben a bélcsoport baktériumainak megkülönböztetésére használják a laktóz fermentációs képessége alapján. Ezek a tápanyagok tápanyag agart, laktózt és egy indikátort tartalmaznak, amely megváltoztatja a színét egy savas közegben - egy pH -indikátort. Ha ilyen környezetben vet el laktózt erjesztő baktériumokat, például E. coli -t, akkor a laktóz erjedése következtében sav képződik, és az indikátor savas környezetben színt vált. Ezért az ilyen táptalajon lévő Escherichia coli telepeket az indikátor színe szerint színezzük: Endo és Ploskirev táptalaján - piros színben, Levin táptalaján - fekete és kék színben. Azok a baktériumok, amelyek nem erjesztik a laktózt, például a szalmonella és a dizentéria botok, színtelenek lesznek.

A Giss táptalajokat („tarig range range”) peptonvíz vagy félig folyékony hús-pepton agar alapján készítik. Bármely szénhidrátot vagy többértékű alkoholt és egy mutatót tartalmazhat. Amikor egy mikrobák nőnek a Giss táptalajon, erjesztve ezt a szubsztrátot sav és gáz képződésével, a közeg színe megváltozik, félig folyékony közegben buborékok és repedések jelennek meg az agar vastagságában, folyékony közegben - gáz buborék egy üveg úszó. Ha a szubsztrátot csak savvá erjesztik, akkor csak a közeg színe változik meg.

Nem egy szénhidrátot, hanem kettőt vagy hármat tartalmazó kombinált közeget is használnak, például Olkenitsky táptalaját. Ennek a közegnek az egyik csöve helyettesíti az agar ferde és Giss táptalajt laktózzal, glükózzal és szacharózzal. Olvadt állapotban végzett sterilizálás után a kémcsőben lévő közeget le kell ferdíteni úgy, hogy oszlopot és ferde részt kapjunk. A vetés ütéssel történik a ferde részen, és szúrással az oszlopban. Laktóz vagy szacharóz erjesztésekor a teljes közeg színe megváltozik; ha egy glükózt erjesztenek, csak az oszlop színe változik. A gázképződést buborékok jelenléte jelzi az agar oszlopban. Amikor a mikrobák ammóniát bocsátanak ki, a közeg színe nem változik. A hidrogén -szulfid képződése az agar -táblázat feketedésével nyilvánul meg

A baktériumok enzimatikus aktivitásának meghatározására szolgáló expressz módszerhez mikroteszt -rendszereket és indikátorpapír -rendszert (NIB) használnak

A mikroteszt rendszer átlátszó polisztirolból készült edény, amely több sejtből áll. A sejtek szárított tápanyagot tartalmaznak szénhidrátokkal és pH -mutatókkal. Egy bizonyos sűrűségű baktériumkultúra szuszpenzióját oltják be minden sejtbe. Sóoldatot öntenek. színeket

indikátor

Az enterobacteriaceae család azonosítására szolgáló indikátorpapír -rendszerek (NIB) a kromatográfiás papír korongjai vagy csíkjai, amelyek védőfóliával vannak bevonva, és tartalmaznak egy specifikus hordozót és egy mutatót. Az indikátor színének megváltoztatásával A hidrogén -szulfid meghatározásához a korong az MPA felületére helyezve, injekcióval beoltva, amely lehetővé teszi a mobilitás egyidejű meghatározását

Minden kémcsőben figyelembe veszik az ugyanazon a napon előzetes eredményt és a másnapi végeredményt.

Az oxidázaktivitást a tenyészet indikátorpapíron történő őrlésével határozzuk meg, és az eredményt egy perc múlva figyelembe vesszük.

Szigetelt szövet és növényi sejtek

Izolált sejtek és szövetek tenyésztése mesterséges táptalajokon steril körülmények között (in vitro) kapta az izolált szövetek tenyésztési módszerének nevét.

Tekintettel arra, hogy a magvú növények a legnagyobb jelentőséggel bírnak az emberi életben, termesztésük módszerei és feltételei jobban kidolgozásra kerültek, mint a tornafélék vagy algák esetében, amelyek steril körülmények között történő termesztése bizonyos nehézségeket okoz. Függetlenül attól, hogy a növények egy adott rendszertani csoporthoz tartoznak, általános követelmények vonatkoznak a kultúrában lévő tárgyak termesztésére. in vitro.

Fertőtlenítés. Először is, a szövet- vagy növényi szerv -fragmentumok - és még inkább az egyes sejtek - töredékeinek tenyésztése teljes aszepszist igényel. A táptalajba bejutó mikroorganizmusok toxinokat szabadítanak fel, amelyek gátolják a sejtek növekedését és a tenyészet halálához vezetnek. Ezért a tenyésztés során a sejtekkel és szövetekkel végzett minden manipulációhozin vitro tartsa be az aszepszis bizonyos szabályait lamináris dobozban vagy aszeptikus helyiségekben. Az első esetben az aszepszist úgy érik el, hogy a kint lévő lamináris dobozból szűrt steril levegőt juttatnak a dolgozóhoz. Az aszeptikus helyiségeket ultraibolya lámpákkal sterilizálják, és steril ruhában dolgoznak. Az aszeptikus helyiségekben lévő asztalok és szerszámok munkafelületét munka előtt alkohollal sterilizálják.

A korábban papírba vagy fóliába csomagolt tiszta edényeket, szerszámokat, papírt, vattát száraz melegítéssel, 160 ° C-os sütőben 1,5-2 órán át sterilizáljuk. A tenyésztőközegeket autoklávban, 120 ° C-on és magas nyomáson 15 percen belül sterilizáljuk. - 20 perc. Ha a tenyésztőközeg olyan anyagokat tartalmaz, amelyek az autoklávozás során lebomlanak, azokat bakteriális szűrőn keresztül történő szűréssel sterilizálni kell. Ezután steril, szűrt komponenseket adunk a 40 ° C -ra hűtött autoklávozott közeghez.

A növényi szövetek maguk is komoly fertőzésforrások lehetnek, mivel az epifitikus mikroflóra mindig a felületükön található. Ezért felületi sterilizálás szükséges, amelyet az alábbiak szerint hajtunk végre. Korábban a növénynek azt a részét, amelyből az extraktumot kivonják, szappannal és vízzel mossák, és tiszta vízzel leöblítik. Ezután a növényi anyagot fertőtlenítőszerek oldatában sterilizálják. Ezen anyagok némelyikét, valamint a sterilizálási időt a táblázat tartalmazza. 6.1.

6.1. Táblázat Az eredeti növényi anyag sterilizálása (R.G. szerintButenko, 1999) Egy tárgy	Sterilizálási idő, min
	savtartalom 0,1%	higany -klorid 0,1%	hidrogén-peroxid, 10-12%
A magok szárazak	15-20	10-15	12-15
A magok megduzzadtak	6-10	6-8	6-8
Őrszövet	20-40	20-25	—
Levelek	1-3	0,5-3	‘ 3-5
Apexes	1-10	0,5-7	2-7

Miután az antitesteket fertőtlenítő oldatban tartottuk, többször mossuk desztillált vízben, és az explanta szeleteken lévő sejtek külső rétegét szikével eltávolítjuk, mivel a sterilizálás során megsérülhet.

Mikroorganizmusok is megtalálhatók a növényi szövetekben. A belső fertőzés leggyakrabban a trópusi és szubtrópusi növényekben fordul elő. Ezért a felületi sterilizálás mellett néha szükség van antibiotikumok alkalmazására is, amelyek elpusztítják a szövetben lévő mikrobiális flórát. Meg kell azonban jegyezni, hogy az ilyen kezelés nem mindig vezet a belső szövetek sterilizálásához, mivel nehéz kiválasztani a célzott antibiotikumot.

Kulturális média. Az izolált sejteket és szöveteket többkomponensű tápoldaton tenyésztik. Összetételükben jelentősen eltérhetnek, azonban minden táptalaj összetétele szükségszerűen tartalmazza a növények számára szükséges makro- és mikroelemeket, szénhidrátokat, vitaminokat, fitohormonokat és szintetikus analógjaikat. A szénhidrátok (általában szacharóz vagy glükóz) 2-3%-os koncentrációban szerepelnek bármely táplálkozási képletben. Táplálkozási összetevőként szükségesek, mivel a legtöbb kalluszszövetben nincs klorofill, és nem képesek autotrófiás táplálkozásra. Ezért szórt fényviszonyok között vagy sötétben termesztik őket. A kivétel a mandraza, az amarant és néhány más növény kalluszszövete.

A táptalaj elengedhetetlen összetevői a ^ auxinok, amelyek az expntáns sejtek dedifferenciálódását okozzák, és a citokininek, amelyek sejtosztódást indukálnak. Amikor ezeknek a fitohormonoknak az aránya megváltozik, vagy ha más fitohormonokat adnak hozzá, különböző típusú morfogenezis alakulhat ki.

A magas nitrát-, ammónium-, kálium-, foszfátion -tartalom elősegíti a sejtek gyors növekedését. A környezet kimerülése jelentősen csökkenti a másodlagos anyagcsere növekedését és folyamatait. A tápközegben eredetileg alacsony foszfáttartalom azonban serkentheti a másodlagos metabolitok szintézisét. Azt találták, hogy az édesgyökér calli tenyésztése olyan táptalajon, amelyen a nitrogén- és foszforkoncentráció fele sötétben van, 1,6 -szorosára növeli a fenolos vegyületek tartalmát a teljes tápközegben termesztett kalliához képest. Az éretlen embriók (kókusz, vadgesztenye stb.) Endospermiumát, néhány fa nedvét, különféle kivonatokat (maláta, élesztő, paradicsomlé) adhatunk a táptalajhoz. Bemutatjuk őket a környezetbe. A do érdekes eredményeket ad, de az ilyen kísérleteket nehéz reprodukálni, mivel a hatóanyag általában nem pontosan ismert. Például a kókusztej külön frakcióinak hozzáadása a tápközeghez nem hozott eredményt, míg a frakcionálatlan endospermium sejtosztódást okozott.

Amikor szilárd táptalajokat készítenek a kallusz szövetek felszíni tenyésztésére, tisztított agar-agart, egy tengeri moszatból nyert poliszacharidot használnak. Példaként a táblázatban. A 6.2. Ábra a leggyakoribb táptalajok összetételét mutatja.

A Murashige és a Skoog környezete a legsokoldalúbb. Alkalmas kalliák képzésére, a kóros kallusz növekedés fenntartására és a legtöbb kétszikű növényben a morfogenezis indukálására. Így az auxin és a kinetin arányának megváltozása bármely gyökér kialakulásához vezet (az auxin túlsúlya), vagy; ősnövények (a kinetin túlsúlya).

A Medium Gamborg és az Eveleg kiválóan alkalmas hüvelyesek és gabonafélék sejtjeinek és szöveteinek tenyésztésére, a White táptalaj * biztosítja a hajtások gyökereztetését és a szár normál növekedését a regeneráció után, a Nitsch és a Nitsch táptalaj pedig az andro indukálására alkalmas.-éngenezis a portokkultúrában.

Fizikai tényezők. A növényi szövetek növekedéséhez és fejlődéséhez; in vitro fizikai tényezők - fény, nagy hatással vannak; hőmérséklet, levegőztetés, páratartalom. |

Könnyű. A legtöbb kalluszszövet gyenge fényben vagy sötét körülmények között nőhet, mivel nem képes fényképezni *; szintetizálni.Ugyanakkor a fény másodszor is morfogenezist biztosító és folyamatokat aktiváló tényezőként működhet.

!A sejtek és szövetek termesztésében használt tápközeg összetétele (R. G. Butenko, 1999 után)	Tápközeg koncentrációja, mg / l
Média összetevő	Murashige és	Gamborg és	Fehér,	Nich és Nich,
	Skoog, 1962	Evelega, 1968	1939	1974-1975
KN03	1900	3000	81	950
NH4NO3	1650	—	—	720
Ca (N03)2	—	—	142	—
Ca (N03)2-4H20	—	—	—	—
(NH4)2S04	—	134	—	—
MgS04-7H20	370	500	74	185
CaCl2H20		—	—	166
CaClr2H20	440	150	—	—
KC1		—	65	—
KH2P04	170	—	12	68
Nem2P04H20	—	150	—	—
MnS04H20	—	10	—	—
MnS0 „-4H20	22,3	—	—	25
ZnS04-4H20	8,6	—	—	—
ZnS04-7H20	—	2	—	10
H3B04	6,2	3	—	10
CuS04-5H20	0,025	0,075	—	0,025
Na2Mo04-2H20	0,25	0,25	—	0,25
CoCl2-6H20	0,025	—	—	—
FeS04-7H20	27,8	—	—	27,8
Na EDTA-2H20	37,3	—	—	37,3
Sequestrene 330-Fe		28	—	—
Mesoinositis	100	—	—	200
C vitamin	—	—	—	3
Tiamin-HCl	0,5	—	—	3
Piridoxin-HCl	0,5	—	—	1
Egy nikotinsav	0,5	—	—	—
Szacharóz	30 000	20000	2000	60 000
Agar "Difco", gél	—	—	—	7000
rith, agarose

th szintézis. Fényforrásként fénycsöveket használnak. A legtöbb lágyszárú növény esetében az optimális megvilágítás 1000 lux körül van. A túl alacsony (300 lux) vagy a magas (3000-10 000 lux) megvilágítás gátolja a növekedést. A megvilágítás befolyásolhatja a kalluszsejtek anyagcseréjét. Így a tea növényi kultúrákban a polifenolok bioszintézise megnövekedett a fény hatására. Éppen ellenkezőleg, a sejttenyészetben Scopolia parvi- flóra a fény elnyomta az alkaloidok képződését. A megvilágítás intenzitása mellett a fény minősége befolyásolja a szövetkultúrát és annak élettani jellemzőit. Így több mint 20 flavon és flavonol -glikozid képződik a petrezselyem sejtkultúrákban, miután megvilágították azt folyamatos, "hidegfehér" lumineszcens fénnyel. Ugyanakkor a flavon -glikozidok szintézise aktiválódik az ultraibolya fénnyel történő egymást követő besugárzással, majd fény a "vörös-hosszú hullámú vörös" tartományban fekszik

Hőfok. A legtöbb kallusz tenyészet esetében az optimális hőmérséklet 26 ° C. Ugyanakkor a Dioscorea deltoid calli- és sejtkultúrái még 32 ° C hőmérsékleten is jól növekednek. V Ellentétben a sejt- és szövetkultúrák növekedésével, morfogenezisük indukálása alacsonyabb hőmérsékletet igényel (18 - 20 ° C). A hőmérséklet hatása a sejtek anyagcseréjére in vitro rosszul tanulmányozták. Bizonyítékok vannak arra, hogy a kallusz tenyészetekben 25 ° C hőmérsékleten figyelték meg az alkaloidok maximális képződését, és a hőmérséklet emelkedésével élesen csökkent. Szuszpenziós sejtkultúrákban Ipomoea a zsírsavak tartalma jelentősen megnőtt, ha nem optimális növekedési hőmérsékleten (15 ° C) termesztették őket. in vitro gondosan tanulmányozni kell az összes abiotikus tényező, beleértve a hőmérsékletet, hatását a sejtek növekedésére és anyagcseréjére.

Levegőztetés. A szuszpenziós növények termesztése szempontjából a levegőztetésnek nagy jelentősége van. Különösen fontos, hogy a tenyésztett sejteket nagy mennyiségű fermentorral levegőhöz juttassuk.

A különböző típusú fermentorok összehasonlításakor kimutatták, hogy a szuszpenziós tenyészetben a másodlagos metabolitok szintézise a legnagyobb, ha alulról szállítják a levegőt. Amikor a sejteket kis térfogatban (lombikokban) tenyésztjük, a szuszpenzió állandó keverésével normál levegőztetés érhető el.

Páratartalom. Az optimális páratartalom abban a helyiségben, ahol növekszem! A termésnek 60-70%-nak kell lennie.

Így a sejtek és szövetek tenyésztése a külső környezet számos tényezőjétől függ, és hatásuk nem mindig jó? stno. Ezért egy új növényfaj kultúrába történő bevezetésekor szükségesT Mindenekelőtt gondosan tanulmányozni kell a fizikai tényezők hatását e kultúra növekedésére és élettani jellemzőire.

Az izolált sejtek és szövetek mesterséges tápközegben, steril körülmények között (in vitro) történő tenyésztését izolált szövetek tenyésztési módszerének nevezik.

Tekintettel arra, hogy a magvú növények a legnagyobb jelentőséggel bírnak az emberi életben, termesztésük módszerei és feltételei fejlettebbek, mint a tornafélék vagy algák esetében, amelyek steril körülmények között történő termesztése bizonyos nehézségeket okoz. Függetlenül attól, hogy a növények egy adott rendszertani csoporthoz tartoznak, általános követelmények vonatkoznak a tárgyak in vitro tenyésztésére.

Fertőtlenítés. Először is a szövet- vagy növényi szervdarabok termesztése - magyarázók, és még inkább az egyes sejtek esetében, teljes aszepszist igényel.Azok a mikroorganizmusok, amelyek beléphetnek a tápközegbe, toxinokat szabadítanak fel, amelyek gátolják a sejtek növekedését és halálhoz vezetnek, ezért az in vitro tenyésztés során a sejtekkel és szövetekkel végzett minden manipuláció során bizonyos aszeptikus szabályokat tartanak be.

Kulturális média. Az izolált sejteket és szöveteket többkomponensű tápoldaton tenyésztik. Összetételükben jelentősen eltérhetnek, azonban minden táptalaj összetétele szükségszerűen tartalmazza a növények számára szükséges makro- és mikroelemeket, szénhidrátokat, vitaminokat, fitohormonokat és szintetikus analógjaikat. A szénhidrátokat (általában szacharózt vagy glükózt) 2-3%-os koncentrációban bármely tápanyagkeverék tartalmazza. Táplálkozási összetevőként szükségesek, mivel a legtöbb kalluszszövetben nincs klorofill, és nem képesek autotrófiás táplálkozásra. Ezért szórt fényviszonyok között vagy sötétben termesztik őket. A táptalaj kötelező alkotóelemei auxinek, amelyek okozzák dedifferenciálódás explanáló sejtek és citokininek, amelyek sejtosztódást indukálnak. Amikor ezeknek a fitohormonoknak az aránya megváltozik, vagy ha más fitohormonokat adnak hozzá, különböző típusú morfogenezis.

Fizikai tényezők. A növényi szövetek növekedését és fejlődését in vitro nagymértékben befolyásolják a fizikai tényezők - fény, hőmérséklet, levegőztetés, páratartalom. A legtöbb kalluszszövet gyenge fényben vagy sötétben nőhet, mert nem képes fotoszintetizálni. Ugyanakkor a fény a morfogenezist biztosító és a másodlagos szintézis folyamatait aktiváló tényezőként is működhet. A legtöbb kallusz tenyészet esetében az optimális hőmérséklet 26 ° C. A szuszpenziós növények termesztése szempontjából a levegőztetésnek nagy jelentősége van. Különösen fontos, hogy a tenyésztett sejteket nagy mennyiségű fermentorral levegőhöz juttassuk. Az optimális páratartalom a helyiségben, ahol a növények nőnek, 60-70%legyen. Így a sejtek és szövetek tenyésztése számos környezeti tényezőtől függ, és ezek hatása nem mindig ismert. Ezért egy új növényfaj kultúrába történő bevezetésekor mindenekelőtt alaposan meg kell vizsgálni a fizikai tényezők hatását e kultúra növekedésére és élettani jellemzőire.

Hozzáadás dátuma: 2016-06-02; megtekintések: 493;

TÖBBET LÁTNI:

Növekvő folyamat sejtek és szövetek mesterséges táptalajokon steril körülmények között (in vitro) az izolált szövetek tenyészetének megszerzésére szolgáló módszer. Az izolált szövettenyészet általában kallusz és sokkal ritkábban daganatos szövetek (3.1. és 3.2. ábra).

Izolált sejtek és szövetek tenyésztése.

Izolált sejtek és szövetek tenyészetének felhasználása.

Az izolált szövetkultúrákat széles körben használják a mezőgazdaságban és az ipari termelésben. Rendelkeznek előnyei összehasonlítva a hagyományos növényi anyagokkal (vadon élő és ültetvényben termesztett növények), nevezetesen:

1. Függetlenség a külső feltételektől.

2. A tenyésztési feltételek optimalizálása.

3. A folyamatok automatizálása és számítógépesítése.

4. A veszélyeztetett növényfajok termesztésének képessége.

5. Gyümölcs-, zöldség- és dísznövények tömeges klonális mikroszaporításának lehetősége.

6. Felépülés vírusos és egyéb fertőzésekből.

7. Lehetőség a kultúrán keresztül in vitro, a tenyésztési munka területeinek bővítése, vagyis a megszerzése klónok sejteket, majd programozott tulajdonságokkal rendelkező növényeket.

A sejtek kultúrában való szintézisének köszönhetően másodlagos metabolitok, új iparág alakult ki, amely elvégezte az ember számára szükséges anyagok biológiai szintézisét.

A szövetek és sejtek tenyésztésének feltételei.

Szöveti töredékek vagy egy növény termesztése - magyarázók, és még inkább az egyes sejtek esetében, teljes aszepszist igényel.

A tenyésztőközegbe bejutó mikroorganizmusok kiválasztódnak méreganyagokgátolja a sejtek növekedését és halálhoz vezeti a tenyészetet. Ezért minden manipuláció sejtekkel és szövetekkel a tenyésztés során in vitro ben az aszepszis bizonyos szabályainak betartásával végezték lamináris doboz vagy aszeptikus helyiségekben. Az aszepszist úgy érik el, hogy steril szűrőt vezetnek be a szűrőkön, a lamináris dobozból kifelé irányítva. A növényi szövetek felszínén mindig van epifitikus mikroflóra. Ezért felületi sterilizálás szükséges, amelyet a növények olyan területeinek kezelésével érnek el, ahonnan magyarázók, fertőtlenítőszerek (hidrogén -peroxid, higany -klorid).

A biológiai anyagokkal való munkavégzéshez a következő összetevőkre van szükség:

- tiszta edények és bioreaktor (fermentor);

- steril tápközeg;

- optimális megvilágítás;

- optimális hőmérséklet;

- optimális páratartalom;

- levegőztetés.

Tisztítsa meg az edényeket és az erjesztőt. A korábban papírba vagy fóliába csomagolt műszereket és vattát száraz hővel sterilizálják szárítószekrény 160 ° C hőmérsékleten 1,5-2 órán át.

Különböző típusú fermentorok használatakor azt találták, hogy a tenyészetek fiziológiai tulajdonságai megváltozhatnak, ezért a szuszpenziós tenyészetben a másodlagos metabolitok szintézisét alulról történő levegőellátással kell elvégezni. Ilyen körülmények között a szintézis sokkal aktívabban megy végbe (3.3. Ábra).

Amikor a sejteket kis térfogatban, például lombikokban tenyésztjük, a szuszpenzió állandó keverésével normál levegőztetés érhető el.

Kulturális média... Az izolált sejtek és szövetek tenyésztése többkomponensű tápközeg... Összetételükben jelentősen eltérhetnek, azonban minden média összetétele szükségszerűen tartalmaz egy összetevőt az alapítás, amelyhez hozzáadják a növények számára szükséges anyagcsoportokat: makro- és mikroelemeket, szénhidrátokat, vitaminokat és fitohormonokat. Az ilyen komponens bázis az agar -agar - a tengeri moszat poliszacharidja, amely képes gélek képzésére vízben, amelyek 45 ° C -on megszilárdulnak. Hozzáadható a táptalajhoz endospermium éretlen embriók (kókusz, vadgesztenye), szirup néhány fa, más kivonatok (maláta, élesztő), paradicsomlé. Bevezetésük a környezetbe pozitív eredményt ad. Mindazonáltal minden aktív komponensnek csak rá jellemző technológiai jellemzői vannak.

Rizs. 3.3. Bioreaktor (fermentor) mikroorganizmusok, sejtek vagy szövetek termesztésére

Az elkülönülés a kalluszképződés folyamatának alapja.

A dedifferenciálás a specializált sejtek visszatérése a merisztematikus állapotba, amikor elnyerik az osztódási képességet.

A növények szervei és szövetei szolgálnak kiindulási anyagként a sejtek és szövetek tenyészetének megszerzéséhez, azonban a növényi leveleket gyakrabban használják erre.

A korábban megmunkált steril levéltöredéket szilárd táptalajra helyezzük. A levelek különböző szövetekből állnak, amelyek sejtjei differenciálódnak, és különböző fehérjék, szénhidrátok, lipidek és más, ezekre a sejtekre jellemző anyagokat szintetizálnak. Ezek a differenciált sejtek nem képesek osztódni.

A lap mechanikai károsodásának folyamatában az expláns felszabadul, és a környezethez hozzáadott növényi hormonok, auxinek és citokininek hatására a sejt dedifferenciált. Elveszíti a tárolóanyagokat - keményítőt, fehérjéket, lipideket, speciális organellákat, kloroplasztokat stb. Ennek eredményeként minden sejt új közeli morfológiai és élettani tulajdonságokat szerez, azaz kallusz (osztó) sejtekké válnak. Kalluszszövet képződik a levélkijelzőn.

A sejttenyészet típusai. A tenyésztés módjától és körülményeitől függően többféle sejt- és szövetkultúra létezik:

- kalluszkultúra;

- szuszpenziós tenyészet;

- egysejtű tenyészet.

Ha termesztése történik felületesen tovább agar tápközeg, akkor kalluszszövet képződik. Nincs világos szerkezete, de sűrűsége változhat. A származás és a növekedési feltételek határozzák meg, hogy a kallusz szövet laza, közepesen sűrű vagy sűrű.

A kalluszsejtek általános jellemzői. A kalluszsejtnek számos közös tulajdonsága van mindenkivel növényi sejtek... Ez a sejtek ontogenitása, bizonyos kedvezőtlen környezeti tényezőkkel és más tulajdonságokkal szembeni ellenállás. Ugyanakkor a tenyésztés során a kalluszsejtek kialakítják saját egyéni jellemzőiket, például fiziológiai aszinkronitást, genetikai heterogenitást és néhányat.

Fiziológiai aszinkron abban rejlik, hogy a sejtek minden egyes pillanatban különböző növekedési fázisokban vannak: egyesek osztódnak, mások növekednek, és mások már öregszenek. Ezért a kalluszsejtek teljes populációjának általános élettani öregedését általában a legtöbb sejt állapota alapján értékelik (3.4. Ábra).

Rizs. 3.4. Kallusz sejtek beRizs. 3.5. Protoplast kijárat

Hozzáadás dátuma: 2016-05-28; nézettség: 1915;

Hasonló cikkek: